VIRUS-Free™ 是一种利用转座子系统进行细胞稳转株的构建和筛选的技术，以替代慢病毒感染构建稳转细胞株的技术。其载体中包括了转座子的识别区域，在转座酶的催化下，将目的片段从载体上或者BAC分子上切割下来形成一个小环结构，并在基因组里面的固定序列位置进行插入，从而实现稳转。目前已经在CAR-T细胞治疗中得到较多的临床应用，并充分体现出其：低成本、高效率、基因表达稳定的特点。

|   技术优势

1.序列完整性好，如果小环的结构被破坏则无法实现基因组插入；

2.可插入大片段，可以实现上百Kb的BAC片段的插入，而且能够保证其序列完整性，可以进行复杂的基因功能研究；

3.目的插入效率高，由于通过酶促反应，所以整个反应的过程效率远远高于DNA随机插入效率；

4.目的基因表达稳定，由于细胞插入的拷贝数相对于病毒来说比较稳定，在稳转株的构建过程中，细胞的表达更加稳定；

5.实验时间只需要慢病毒系统时间一半，实验更加安全；

6.可以实现：稳转之后对目的克隆进行检测后可以再将目的基因在原克隆移除，轻松实现加减法的对照。

|   技术流程图

|   VIRUS-Free™ 细胞基因稳转技术

2Kb以内基因插入（合成法）

插入片段小于2Kb的项目，我们将通过化学合成的办法获得质粒，并进行细胞转导，通过抗药性的筛选获得稳转克隆。

2-20Kb的基因插入（载体法）

插入片段2-8Kb的项目，我们将通过载体构建的办法来获得质粒，并进行细胞转导，通过抗药性的筛选获得稳转克隆。

Step1. 目的序列PCR扩增

Step2. 目的载体的构建获得表达载体

Step3. 目的细胞的转导和抗性药物筛选获得目的克隆

BAC片段细胞系稳转（BAC修饰）

通过Red重组系统对BAC进行遗传修饰获得重组BAC，并进行细胞转导，通过抗药性的筛选获得稳转克隆。

Step1. 目的序列PCR扩增

Step2. 通过Red重组获得经过遗传修饰的BAC

Step3. 目的细胞的转导和抗性药物筛选获得目的克隆

|   案例分析

VIRUS-Free™ 技术在构建稳转株中的应用

1. 实验目的

利用VIRUS-Free™ 技术构建表达荧光的稳转株，并验证所获得的细胞株的稳定性。

2. 实验用品

细胞：人结直肠癌细胞HCT116（Cas9X自有细胞库，经培养验证其生长状态、增殖速度、克隆形成率、电转阳性率等均良好）

质粒：VIRUS-Free™ 构建的EGFP-Puro载体（结构如下图）

试剂：细胞培养相关试剂、电转液、多聚甲醛固定液

仪器：电转仪、NovoCyte Advanteon流式细胞仪（NovoExpress软件）

3. 实验步骤

收集Pn/Pn+3/Pn+4……Pn+n，流式上机，对比各组GFP阳性率及强度

4. 实验结果

4.1   电转

按照适当比例，向备好的细胞样品中加入VIRUS-Free™ 质粒，充分混匀后对细胞进行电转。24h后观察荧光表达效果，GFP阳性率约50%。

24h后镜下观察Pn细胞GFP表达

4.2   药筛

继续培养上述Pn细胞至48h，加入含一定浓度抗性药物puro的完全培养基，同时用该培养液培养野生型细胞作为对照组。3天后，对照组细胞已全部死亡，实验组细胞荧光表达良好，流式GFP阳性率95.72%。

药筛3天后镜下观察Pn细胞荧光表达

流式检测GFP阳性数据，(a)野生型散点图；(b)野生型直方图；(c)转染细胞直方图，GFP阳性率为95.72%

4.3   传代

将上述Pn细胞预留一部分进行若干次传代，传代过程中使用不含药物的培养基。

从Pn+3开始，每次传代均取样固定待测定流式，直到Pn+9结束传代，GFP均稳定表达。

Pn+1细胞荧光表达

Pn+9细胞荧光表达

5. 实验结论

A. 利用VIRUS-Free™ 系统能够构建表达目的基因的稳转株；

B. 与常规质粒相比，VIRUS-Free™ 系统转导的细胞，显著表达时间为3-5天，时间因细胞而异；

C. 利用VIRUS-Free™ 系统获取的稳转株，经过药筛可稳定长时间高效地表达目的蛋白。