VIRUS-Free™ 是一种利用转座子系统进行细胞稳转株的构建和筛选的技术，以替代慢病毒感染构建稳转细胞株的技术。其载体中包括了转座子的识别区域，在转座酶的催化下，将目的RNA干扰片段从载体上切割下来形成一个小环结构，并在基因组里面的固定序列位置进行插入，从而实现稳转，并开始表达RNA干扰分子，实现对细胞固定基因的mRNA靶向Knockdown。
| 技术优势
1. 速度快，只需要构建载体；
2. 可插入多组不同的干扰序列，可以同时靶向多个mRNA，可以进行复杂的基因功能研究；
3. 目的插入效率高，由于通过酶促反应，所以整个反应的过程效率远远高于DNA随机插入效率；
4. 目的基因表达稳定，由于细胞插入的拷贝数相对于病毒来说比较稳定，在稳转株的构建过程中，细胞的表达更加稳定，干扰效果稳定；
5. 实验时间只需要慢病毒系统时间一半，实验更加安全；
6. 可以实现：稳转之后对目的克隆进行检测后可以再将shRNA在原克隆移除，轻松实现加减法的对照。
| 技术流程图
| VIRUS-Free™ 细胞RNA干扰技术
我们将通过载体构建的办法来获得质粒，并进行细胞转导，通过抗药性的筛选获得稳转克隆。
Step1. 目的干扰序列合成
Step2. 目的载体的构建获得干扰的VIRUS-Free™ 载体
Step3. 目的细胞的转导和抗性药物筛选获得目的克隆
| 案例分析
项目名称：利用shRNA技术在RAW264.7细胞系中实现mAimp1的稳定敲除
· 采用了VIRUS-Free™的转座子系统进行稳定的基因组整合（图1）。
· 设计了三个高度特异性的针对mAimp1的shRNA（图2），并筛选出了最佳的敲除效果。
· 通过qPCR和WB检测了稳定细胞系中的敲除效率（图3）。
图1. 质粒图谱
图2. shRNA敲低策略
图3. mAimp1敲低的验证：mRNA和蛋白水平检测
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IF: 45.5 Chen Y, Chen S, Liu Z, Wang Y, An N, Chen Y, Peng Y, Liu Z, Liu Q, Hu X. Red blood cells undergo lytic programmed cell death involving NLRP3. Cell. 2025 Apr 16:S0092-8674(25)00389-7. | IF: 39.3 Ma B, Ju A, Zhang S, et al. Albumosomes formed by cytoplasmic pre-folding albumin maintain mitochondrial homeostasis and inhibit nonalcoholic fatty liver disease[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2023, 8(1): 229. | IF: 26.6 Wu W, Pu Y, Gao S, et al. Bacterial Metabolism-Initiated Nanocatalytic Tumor Immunotherapy[J]. Nano-Micro Letters, 2022, 14(1): 1-21. | IF: 37.3 Zheng Z, Zeng X, Zhu Y, et al. CircPPAP2B controls metastasis of clear cell renal cell carcinoma via HNRNPC-dependent alternative splicing and targeting the miR-182- 5p/CYP1B1 axis[J]. Molecular Cancer, 2024, 23(1): 4. | IF: 18.9 Sun J, Yang F, Wang L, et al. Delivery of coenzyme Q10 loaded micelle targets mitochondrial ROS and enhances efficiency of mesenchymal stem cell therapy in intervertebral disc degeneration[J]. Bioactive Materials, 2023, 23: 247-260. | IF: 18.9 Wei X, Wang L, Duan C, et al. Cardiac patches made of brown adipose-derived stem cell sheets and conductive electrospun nanofibers restore infarcted heart for ischemic myocardial infarction[J]. Bioactive Materials, 2023, 27: 271-287. | IF: 16 Gao Y, Zhu Y, Wang H, et al. Lipid-mediated phase separation of AGO proteins on the ER controls nascent-peptide ubiquitination[J]. Molecular Cell, 2022, 82(7): 1313-1328. e8. | IF: 15.1 Chen X, Hao Y, Liu Y, et al. NAT10/ac4C/FOXP1 promotes malignant progression and facilitates immunosuppression by reprogramming glycolytic metabolism in cervical cancer[J]. Advanced Science, 2023, 10(32): 2302705. | IF: 12.8 Yang H H, Jiang H L, Tao J H, et al. Mitochondrial citrate accumulation drives alveolar epithelial cell necroptosis in lipopolysaccharide -induced acute lung injury[J]. Experimental & Molecular Medicine, 2022, 54(11): 2077-2091. |
