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CRISPR-gRNA文库

|   CRISPR-gRNA文库筛选基因靶点服务

CRISPR-gRNA文库是高通量筛选靶基因的重要工具,可用于大规模或全基因组功能筛选,涉及信号通路、疾病、细胞药物应答、发育、基因调控等方面。海星生物在gRNA文库筛选方面拥有丰富的经验,能够帮助客户快速构建CRISPR KO(基因敲除)、CRISPRa(基因激活)文库CRISPRi(基因抑制/沉默),也可以为客户提供全套的细胞功能筛选服务,涵括文库构建、病毒文库、细胞转染和筛选、NGS测序与数据分析服务。


|   CRISPR-gRNA文库服务流程和优势

CRlSPR/Cas9是细菌和古生物菌用来抵抗外来入侵的一种获得性免疫系统。利用CRlSPR/Cas9技术建立的全基因组突变(基因敲除)库或者与某类功能相关的基因突变体(基因敲除)库,通过功能性筛选和富集以及随后的PCR扩增和深度测序(NGS)分析,筛选出与感兴趣的表型相关的基因的过程,被称为CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选。gRNA文库筛选是药物筛选或靶向筛选特定通路的理想工具,可以拨开基因研究的迷雾,为研究者找出相关的基因。文库筛选是将功能基因筛选、疾病机制研究及药物研发等方面结合在一起,必将发挥重要价值。


CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选流程:

1. CRlSPR/Cas9 gRNA文库选择;

2. CRlSPR/Cas9 gRNA文库扩增;

3. CRlSPR/Cas9 gRNA文库慢病毒包装;

4. CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选;

5. PCR扩增和NGS测序、数据分析;


1、CRlSPR/Cas9 gRNA文库选择

首先客户选择所需gRNA文库。如果客户根据具体需要提出文库定制,我们将根据客户提供的基因群信息进行单个基因的gRNA设计,保证每个基因设计4~6个(2~3对)不同的gRNA,最大程度确保基因功能的突变。我们采用的载体是单/双载体,单载体是一个载体上同时携带单个gRNA和cas9基因,双载体是一个载体上只有单个gRNA,cas9蛋白则由单独携带cas9的载体提供。这两种模式载体均携带有额外的抗性筛选标记。

服务优势:设计文库构建方案

我们拥有强大的计算机资源和优化的流程。不需要您提供备选的gRNA序列,我们可以为您全新设计。您可根据研究需要精准度和深度,选择我们经过验证的载体骨架来构建文库,如慢病毒等。对于双载体系统CRISPR文库(CRISPR载体和gRNA载体),我们还可以根据您的筛选策略,设计和构建相应的Cas9或Cas9变体表达载体,满足多种研究的需求。

2、CRlSPR/Cas9 gRNA文库扩增

经合成的片段一般较少,不足以进行文库的慢病毒包装和使用。因此,需要对上述载体进行扩增,增加总量。上述gRNA载体构建完成后,我们将这些载体按相同的比例混合成一个pool(即载体混合物),随后将载体混合库使用专用电转感受态(高效率感受态),电转扩增培养并收集菌落,并进行扩大培养,最后大规模抽提质粒,即得到了扩增后的载体混合库,也就是敲除的载体文库。

服务优势: 精准PCR扩增构建CRISPR文库

我们使用芯片合成的方法获得高质量的gRNA引物库。以引物库为模板,使用最低有效循环数进行PCR扩增,并以平均100x的覆盖率克隆到目的载体骨架上。将CRISPR文库质粒DNA转化大肠杆菌进行扩增培养后,取对数生长期的菌液制备成甘油菌进行保存。评估文库的质量,对gRNA质粒DNA库进行NGS测序分析,测序深度将达到500x覆盖率,分析出来的数据将形成报告。

服务优势:预制质粒DNA文库的扩

我们可以接受其他来源(例如Addgene)的预制质粒DNA文库。首先我们会将质粒DNA文库转化超级感受态细胞,达到100x覆盖率,取对数生长期的大肠杆菌培养物制备成甘油菌。同时我们还会对转化后的菌落进行计数以评估gRNA实际平均数量。并将质粒DNA文库交付大提,并进行病毒包装。我们可以在转化前和/或转化后对您的质粒DNA文库进行NGS测序验证。对于您提供的质粒DNA文库,我们可以通过克隆计数保证达到100x覆盖率,但不能保证文库的多样性和均一性,因为我们无法控制您的预制质粒DNA库质量。

3、CRlSPR/Cas9 gRNA文库质粒质检、抽提、慢病毒包装

扩增后的gRNA文库进行慢病毒的包装。由于文库是由多个不同的gRNA载体混合而成,因此我们获得的慢病毒是病毒文库,但是里面的每个病毒携带单个gRNA载体。

服务优势:病毒文库的包装

对于CRISPR文库筛选,需要通过病毒(如慢病毒或腺相关病毒)将文库转到细胞中。而具体的转染的效果需要进行MOI测试,我们可以依据客户的需求进行目的细胞的病毒感染的MOI优化和摸索。

4、CRlSPR/Cas9 gRNA文库筛选

对筛选的目的细胞进行病毒感染预实验,得到细胞在较低的MOI时感染百分数,以确认感染时gRNA文库的病毒用量。慢病毒库以较低的MOI值感染细胞(确保每个细胞只进入一个慢病毒),随后根据实验目的而对细胞采用相应的处理,最后经过不同的筛选方式富集细胞。以耐药性基因筛选实验为例,根据前期药物IC50实验,得到药物筛选实验的处理浓度。采用高浓度药物处理感染后的细胞,经过筛选后存活的细胞则具有一定的耐药性,将此群细胞扩增并收集下来,耐药性的来源是CRlSPR/Cas9 gRNA对相应基因的修饰。

5、PCR扩增和NGS测序

对上个环节筛选中富集下来的细胞进行慢病毒载体的PCR扩增,该扩增片段包含载体所携带的gRNA序列,通过后续的NGS测序,我们可以得到富集细胞中gRNA的富集度,从而寻找到相应的基因,这些基因很有可能参与药物作用过程,因此可作为深入研究的待选基因。

服务优势:功能筛选样品NGS测序分析

功能筛选后,可以直接将基因组DNA样品寄送给我们,我们将为您制备NGS样品、高通量测序和数据分析,并在短短几周内告知您样品的gRNA的分布情况。测序完成后,我们会通过电子邮件通知您,并附带详细的数据报告。



|   CRISPR文库遗传筛选的常规流程

文库构建、病毒文库、细胞测试


|   服务类型介绍:

文库构建、病毒文库、细胞测试

*海星生物提供现货供应,针对Human和Mouse全基因组范围的基因敲除(CRISPR KO)gRNA文库,实现全基因范围内功能基因的高通量快速筛选。

*海星生物还可以按照需求为客户设计合成靶向特定通路或者基因的gRNA订制文库。


|   案例分析

Nature Genetics,A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors

美怀特海德研究所、拉根研究所和布罗德研究所的研究人员利用CRISPR-Cas9基因编辑技术找出三个有望用于治疗HIV感染的新靶标。

研究者利用CRISPR敲除筛选的策略,将影响HIV感染,同时又是细胞存活非必需的基因。一共找出5个基因,其中它三个在早前的利用RNA干扰(RNAi)的研究中并未被鉴定。

作者描述:我们的研究HIV感染的主要靶标,并找出在病毒对T细胞的感染中起着最为显著性作用的宿主基因。之前的研究已找出几种宿主依赖性因子,包括HIV侵入CD4阳性T细胞所需的两种蛋白:CD4分子、CCR5,唯一被认为治愈HIV感染的一个人就是接受来自携带这种CCR5突变的供者的骨髓移植。2008年的三项利用RNAi鉴定潜在的宿主依赖性因子的研究鉴定出800多种可能的靶标;但是这些结果很少存在重叠,提示着存在较高的假阳性。

原因是:RNAi抑制但不会完全阻断基因表达,这可能允许靶基因产生足够多的蛋白来允许HIV感染,而且它也能够抑制靶基因之外的其他基因表达,从而导致假阳性结果。利用CRISPR对源自HIV敏感性的CD4阳性T细胞的一种细胞系进行筛选,研究人员鉴定出5个基因:当让它们失活时,会让细胞免受HIV感染,同时不会影响细胞存活。


文库构建、病毒文库、细胞测试



A pooled, genome-wide CRISPR screen for HIV HDFs. (a) Outline of the genome-wide CRISPR screen strategy. WT, wild type; KO, knockout. (b) Flow cytometry analysis (representative of five independent experiments) of cells infected with the HIV-1 strain JR-CSF and expressing GFP as a reporter of productive HIV infection. Where indicated, cells were transduced with sgCCR5 or an sgRNA that does not target protein-coding sequences
in the human genome (nontargeting control). (c) Flow cytometry analysis (representative of three independent experiments) quantifying CD4 and CCR5 expression on the surface of wild-type GXRCas9 cells and GXRCas9 cells that were transduced with the genome-wide sgRNA library and serially infected with HIV-1 strain JR-CSF. (d) Log2-transformed fold change in the abundance of the fifth most enriched sgRNA for every gene following HIV infection. See also supplementary Figure 1 and supplementary table 1. (e) Enrichment of individual sgRNAs for three candidate HDFs and two control genes. Values indicate log2-transformed fold change in abundance following HIV infection. Values for the uninfected group are from GXRCas9 cells that were transduced with the genome-wide sgRNA library and cultured for 3 weeks.


Cas9X 海星生物可以为病毒感染筛选相关的靶向基因提供:全基因组的gRNA病毒、细胞株的构建、验证细胞株的敲除等成熟的技术支撑。


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