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服务咨询:18626127718
细胞STR鉴定服务
细胞支原体检测
染色体核型分析
细胞流式检测服务
细胞基因序列检测
细胞克隆形成率检测

STR(Short Tandem Repeat,短串联重复序列)基因分型已被ICLAC、ATCC等权威机构作为鉴别细胞身份及交叉污染的金标准。海星生物对人源细胞21个STR位点进行检测,可方便与权威数据库进行比对,具有极高的准确性。

STR基因位点由长度为3~7个碱基对的短串连重复序列组成, 这些重复序列广泛存在于人类基因组中,可作为高度多态性标记,被称为细胞的DNA指纹。STR 基因座位上的等位基因可通过扩增区域内重复序列的拷贝数的不同来区分,在毛细管电泳分离之后可通过荧光检测来识别。随后通过一定的计算方法,即可根据所得的STR分型结果与细胞STR数据库比对从而推算出样品所属的细胞系或可能的交叉污染的细胞系名称。


|   海星生物细胞系鉴定位点

人源细胞STR位点信息

TH01

AMEL

TPOX

D2S441

D3S1358

D13S317

D12S391

D5S818

VWA

D7S820

D2S1338

D8S1179

CSF1PO

D21S11

D19S433

D16S539

D18S51

PENTAD

PENTAE

D6S1043

FGA


|   细胞系鉴定服务流程

细胞系鉴定服务流程.jpg


|   细胞STR鉴定样本要求

· 细胞样本:

常温细胞样本使用T25瓶寄送,细胞数≥10^6 cells ;

冻存管细胞样本使用干冰寄送,细胞数≥10^6 cells;

细胞沉淀样本使用冰袋寄送,细胞数量≥10^6 cells


· DNA样品:

0D260/0D280=1.8~2.0;DNA浓度≥50ng/μl, DNA体积≥20μL


· 样本请务必低温运输!


|   案例分析

人源细胞系21基因位点STR分型图谱示例:

/ueditor/image/2022/01/19/5a73fec67c3b7b2c6f0ce228f41b515d.png

STR分型图谱示例:

/ueditor/image/2022/01/20/bdd061a88d7afed9102acd50b25d09f5.jpg

细胞培养物的支原体污染很普遍,在已发表的报告中范围从5%~35%[1]。使用受污染的细胞会损害细胞生理学的几乎所有方面,包括基因表达、细胞增殖抑制、细胞凋亡、成瘤变化等,从而影响任何实验的结果结论[2~3]。控制支原体污染最重要的是对所有进入实验室的细胞都经过严格的支原体检测,排除所有的污染细胞株。目前发表高分研究文章,对细胞的支原体要求越来越高,已经是高分文章的必备检测。HyCyte®所有的细胞株均通过支原体PCR检测阴性,培养体系不添加抗支原体试剂。

图1   细胞感染支原体的电镜照片 (Image source: ATCC)


|   快捷支原体检测方法:


海星生物的支原体检测试服务是使用高灵敏度的PCR检测法,可检测细胞培养物中常见的90多种支原体,检测下限达到10 Copies/mL。

海星生物“快捷支原体检测”服务

单次样品数(个)

价格(元)

周期(周)

样品形式

备注

1-4

180/

1

细胞沉淀

培养上清

冰袋运输

中英报告

邮箱发送

5-10

100/

1

11-20

80/

1

20

78/

1

1

880/

3

提供CMA报告


图2   支原体PCR检测数据


哺乳动物细胞支原体污染特征:

在污染的早期阶段,支原体通常不会引起培养基的pH变化,也不会对哺乳动物细胞产生显着的毒性作用。支原体主要生长在哺乳动物细胞膜上。在许多情况下,支原体污染没有明显迹象。但是后续支原体污染的加剧会引起细胞生长速度显著下降、细胞代谢被抑制、核酸合成被抑制、细胞染色体畸变、细胞膜抗原特征变化[4]、并在污染严重后产生很多小黑点,显著改基因转染率和病毒感染效率,影响细胞的基因表达水平。目前支原体污染比较快捷和灵敏的方法就是进行支原体核酸PCR检测。

哺乳动物细胞支原体污染途径:

支原体污染方式是支原体感染细胞与未感染细胞系的交叉污染发生的。该途径主要是移液过程中产生的气溶胶在公用超净台发生交叉污染,所以在工作流程中,需要始终注意“从干净到污染”的处理细胞流程。首先处理未受污染的细胞,其次是未知或未检测的细胞,最后是疑似或已知受污染的细胞。受污染细胞都不应该在在实验室中保留,包括液氮罐[5]。再有就是80%的实验室技术人员是支原体携带者,支原体污染可以通过一个喷嚏甚至说话间发生污染,所以必须做好人员的防护。

哺乳动物细胞支原体污染预防:

l 实验人员始终穿戴个人防护装备:包括消毒的实验外套、手套(经常更换或消毒),佩戴口罩。

l 严格控制细胞来源,务必从能够提供准确PCR检测的细胞库获取细胞。支原体能在液氮中存活,因此在将新细胞需先隔离存放,待检测合格后再放入液氮罐。

l 良好的无菌操作,必须注意液体操作过程中培养基滴漏并迅速清洁任何滴落的液体,及时更换移液器吸头并避免在细胞操作区域说话等会有气溶胶产生的行为。

保持整个实验室空间清洁。细胞操作区应移除无关物品包括纸皮箱等,并每周进行消毒。




|   支原体污染的危害


支原体是实验室中常见的污染细胞的原核生物,据统计约有15%-35%的细胞被支原体污染。支原体会改变宿主细胞的结构和功能等一系列特征,造成实验结果不正确;干扰细胞代谢和生长,改变核酸合成,影响细胞抗原性,导致染色体改变,干扰病毒复制以及模仿病毒的作用。因此,每一株外来细胞在进入实验室之前,都应进行支原体检测,并且应对培养中的细胞定期(如每2-3个月)进行支原体检测。


建立定期的监控方案,有助于提高科研效率,在污染发生在早期时及时处理。可避免支原体污染造成更大的损失!


体外培养环境中,细胞自身没有抗污染的能力,即使培养基会添加抗生素,抵抗污染的能力也很有限。常见的微生物污染为细菌、真菌、支原体和病毒等,其中又以支原体污染最为普遍棘手。一旦污染了支原体的细胞将无法正常形成单克隆,而且细胞转染过程容易死亡,细胞实验效率极低。为了维持实验的稳定,必须对所有的实验使用到的细胞进行支原体的检测。

支原体污染后,细胞不会有明显的死亡现象,且支原体通常能与细胞长期共存,培养体系亦无浑浊现象,然而实际上却可能存在细胞形变,DNA合成受抑制等诸多问题,并且即使发现支原体污染也较难彻底清除,因此确保细胞在实验初期无微生物污染是至关重要的。
采用PCR法对目的细胞进行细菌、真菌和支原体等检测。以微生物16(18)SrRNA基因为靶基因,设计通用引物并建立PCR扩增体系。

如常用的两个针对16S rRNA基因的通用引物对为27F, 1492R和63F, 1387R。
27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1492R:5'-TACCTTGTTACGACTT-3'
63F:5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’;1387R:5’-GGGCGGTGTACAAGGC-3’


细胞检测技术服务


图1   细胞样品为PCR阳性,将PCR产物送测序,经BLAST比对为牛支原体


研究调查表明,约有20多种支原体能污染细胞(尤其是传代细胞),95%以上是牛源性,常见为口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.Hyorhinis)和菜氏无胆甾原体(A.laidlawii)。

通用的快速基因诊断技术,经大量实验证实,能保证所选引物具有良好的保守性和特异性,重复性好且操作简单,相较于传统的微生物培养法,能有效地缩短实验周期至3天,达到快速反馈检测结果的目的。

|   支原体去除案例

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细胞染色体核型分析是以分裂中期染色体为研究对象,根据染色体的长度、着丝点位置、长短臂比例、随体的有无等特征,并借助显带技术对染色体进行分析、比较、排序和编号,根据染色体结构和数目的变异情况来进行诊断。核型分析可以为细胞遗传分类、物种间亲缘的关系以及染色体数目和结构变异的研究提供重要依据。海星生物可提供细胞核型检测服务,可提供染色体自然分布图,高清G带分析图。


|   海星生物核型分析流程


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|   海星生物核型分析样本要求

· 活细胞


|   提供结果

· 核型分析检测报告。


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1. 细胞表面标记检测服务
流式细胞术(FCM)已广泛地应用于基础研究,并逐步进入临床检测,用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析,可区别多种细胞。细胞表面标记主要包括表面受体和表面抗原,对细胞表面标记的检测已广泛用于基础、临床免疫学研究和患者免疫功能的测定,如对间充质干细胞表面标记检测。

2006年国际细胞治疗协会(ISCT)规定了间充质干细胞的最低鉴定标准:
基本条件下贴壁生长
表达CD105、CD73、CD90,

不表达CD45、CD34、CD14/CD11b、CD79a/ CD19、HLA-DR;
体外可以诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞。
采用细胞表面标记抗体试剂盒对不同的间充质干细胞进行流式鉴定。


细胞检测技术服务       

图1   Human MSC检测指标分别有CD105(+)、CD29(+)、CD73(+)、CD34(-)、CD45(-)、CD11b(-)、CD44(+)

2. 细胞凋亡检测服务
细胞凋亡是细胞的基本特征之一,它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。通常使用细胞凋亡检测试剂盒,如常见的Annexin V荧光双染法,其检测原理为:Annexin V/ Annexin A5为胞内蛋白膜联蛋白家族成员,以钙依赖的方式与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。PS存在于正常细胞浆膜的内层,但在凋亡早期,膜不对称性丧失,PS易位至细胞表面。荧光标记的 Annexin V可与之特异性结合,表明该细胞为早期凋亡细胞。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液,碘化丙啶可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞,呈现红色荧光。

细胞检测技术服务

图2   活细胞比例约88.14%,凋亡早期细胞约1.68%,
凋亡晚期或坏死细胞约2.66%,裸核细胞约7.53%


3. 细胞周期检测服务
碘化丙啶(Propidium,简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光,并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后,可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定,然后根据DNA含量的分布情况,可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。
碘化丙啶染色后,假设G0/G1期细胞的荧光强度为1,那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2,正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组DNA片段在染色过程中丢失,因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染,即荧光强度小于1,在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰,即凋亡细胞峰。

细胞检测技术服务

图3   细胞周期拟合图

Cas9X拥有自有流式检测和流式分析分选平台,

可以为膜蛋白基因敲除的客户提供膜蛋白流式检测和细胞分选富集服务。

细胞株在传代的过程其染色体会不断的断裂和变化,导致其很多目的基因的位置和基因库的信息会出现差异,为了保证稳定的基因编辑效果,我们会对细胞株的基因编辑位点进行测序,确保gRNA能够发挥作用,排除由于基因突变导致gRNA失活的问题。
根据gRNA打靶位置基因组序列设计上下游引物,提取野生型细胞基因组进行PCR。将PCR产物送测序,判断目的细胞基因型是否正确,便可以判断该gRNA是否与该细胞株匹配。
同时可以保留本次使用的引物,用于打靶修饰后的阳性细胞PCR鉴定是否有敲除效果。
基因型检测的周期为7天。

gRNA-A1的位置序列:
CCGATGAGAAGCAGCGCTGAGGACTTGAAGTAGAGGGAGGAGGGCAGGCCTCGGAGCAGCGGGAGCAGCGGGA

细胞检测技术服务


gRNA-A2的位置序列:
TTCCCTGTCGAGAGCTAGACGTGGACAGGCGCCGCCGCGTAGATCCGGGGGAGGCTCCCAAATTGGAACCAGT

细胞检测技术服务

图1   根据gRNA打靶位置及其附近基因组序列设计上下游引物


如上图所示:所有的序列均与预测效果一致,该gRNA和细胞可以用于后续的实验。

由于不同细胞各种生长特性都具有较大差异,因此对于需单克隆化的细胞,早期要鉴定其克隆形成的能力。我们在收到客户提供的细胞之后会马上安排进行细胞克隆形成能力的检测,是后续实验顺利进行的最重要的保证。
将目的细胞分别按照50、100、200个的数量接种至培养器皿中,通常需经过14天的培养周期,则可观察目的细胞形成克隆的情况。根据结果判断目的细胞单克隆化的难易程度,这对选择后续的实验方法具有很重要的指导意义。同时在选择细胞进行实验的时候也要关注所选的细胞株的克隆形成率数据。


细胞检测技术服务

图1   目的细胞培养14天后克隆形成情况


目的细胞单克隆形成能力的主要判断依据如下
1. 克隆数量:克隆形成率优良的最主要的判断依据。
2. 大克隆数量:判断筛选克隆时实验操作的难易程度。
3. 形成可观克隆的天数:若周期14天内形成可观克隆,则判断目的细胞形成单克隆能力好;超过14天才形成可观克隆,或者始终无法形成克隆的,则目的细胞形成单克隆的能力差。

如遇克隆形成能力差的情况,会影响总体实验的进度,必要时会建议更换细胞进行实验。


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