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| siRNA的设计原则

siRNA是否能起到特异性沉默目的基因作用,siRNA序列的设计,是关键的因素之一,或者说是最重要的因素。

以下是设计siRNA遵循的一般原则和步骤:

1. 确定靶基因,并针对靶基因序列进行一些简单的生信分析,了解该mRNA转录本的基本结构信息,及这个基因的不同转录本,基因或基因上SNP位点多态性,功能域等一些基础信息;并针对该基因,查询相关数据库,看是否有已验证过的siRNA序列。有则尽量优先用验证有效的序列,没有则自行设计;

2. 一般首选靶基因的CDS区域作为siRNA的同源区,其次才选择3’UTR;一般不建议选择5’UTR;

3. siRNA碱基组成方面,一般建议GC含量在(30-52%),并避免单碱基连续4个以上的重复区域,一般选择AA开始区域(这样对应的反义链以uu作为3’末端);

4. 如果直接合成siRNA,则注意退火后的siRNA是5’缩进,3’突出的;一般是突出2个碱基;

5. 序列内部(即siRNA核心序列)避免稳定的二级结构;

6. 候选siRNA区域确定后,还需要对本种属做对库搜索,避免与其它基因同源;

7. 一个靶基因,需要选定3-5个合格的siRNA位点供筛选;即需要合成3-5套siRNA或构建3-5个shRNA载体;

8. 一般还需要提供一个阴性对照(阴性对照最好是与siRNA序列碱基组成相似但与靶基因及种属其它基因没有同源性);最好还有一个阳性对照(阳性对照选用同种属其它靶基因已验证过的siRNA序列)

| shRNA

shRNA,短发卡RNA(short hairpin RNA),是指插入到相应表达载体(比如慢病毒)中的针对目的基因的特定序列(经过设计和筛选的高效且特异抑制目的基因)和特定结构(由loop序列区隔开的反向重复序列),在体内启动转录,形成发卡结构,在体内的DICER及RNase作用下,形成siRNA并诱导RNA干扰抑制特定基因表达。它通常由3个元件构成:一个转录启动子,一个shRNA前体序列和一个转录终止信号。


shRNA具有较强的基因沉默能力,在体内转录后经过酶切形成siRNA分子,通过与RNA干扰复合体(RISC)结合,降解特定的mRNA分子,进而对特定基因表达进行调控。shRNA技术已广泛应用于基因功能研究和基因治疗等领域。





| shRNA的特点

1.靶向性强

理论上,shRNA能够对目标基因进行特异性的抑制,而不影响其他基因的表达。这种靶向性强的特点使得shRNA在基础研究和临床治疗中有着广泛的应用前景。


2.适用范围广

shRNA可以用于多种类型的细胞和生物体系中,并且能够针对多种不同的基因进行沉默。这种特点使得shRNA成为了研究和治疗各种疾病的重要手段。


3.操作简单

与其他基因敲除技术相比,shRNA的设计、合成和操作相对简单。通常只需要将shRNA序列克隆到质粒或病毒载体中,然后导入到细胞内即可实现基因沉默效应。


4.抑制效果持久

shRNA可以在细胞内诱导长期的基因沉默效应,其抑制效果可以持续几天甚至数周。这种特点使得shRNA成为了研究和治疗需要长期监测的疾病的重要工具。


5.技术成熟

自从RNA干扰技术被发现以来,shRNA设计和合成技术已经不断完善,且有多种商业化产品可供选择。这种技术成熟的特点保证了shRNA在实际应用中的稳定性和可靠性。




| shRNA与siRNA区别


shRNA

siRNA

稳定性

低,易降解,寿命短

作用时效

作用时间较长,持续数星期甚至更长

作用时间较长,持续数星期甚至更长

脱靶率

导入方式

质粒载体,普通转染

;病毒导入,克服转染困难的细胞导入

普通转染,困难细胞难易转染

表达方式

聚合酶II型和III型启动子驱动;

可使诱导表达系统;

可以与报告基因共表达,可视化细胞导入效率

直接化学合成

抑制效果检测时间

取决于靶蛋白的半衰期

shRNA较之siRNA具有细胞内表达更稳定,抑制靶基因作用更长久并可传递给子一代等优势,解决了siRNA无法长期稳定沉默目的基因的缺陷。


咨询请致电 400-990-6627 / 18626227506(微信同号)




| shRNA载体构建

shRNA可以克隆到表达载体并表达siRNA 分子,我们可以根据目的基因设计shRNA序列并将其克隆到表达载体中。

(1)克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列,中间被一茎环(loop)序列分隔开,形成一个发夹结构,由RNA聚合酶III转录。

(2)两条DNA链互补且两端带有限制性酶切位点,以便之后载体构建。

(3)在启动子下游的切割位点下方紧连一个C,使插入片段和起始子之间有一定的空间,以保证基因转录的发生。

(4)shRNA的正义链5’端必须有一个G,其目的是为了保证RNA聚合酶可以准确识别并转录。

(5)插入的shRNA的茎环应当靠近双链的中心位置。

(6)为了保证RNA聚合酶Ⅲ可以终止转录,5-6个dT必须放置在shRNA插入片段的末端(Pol III转录终止是由DNA非模版链上连续的4~7个脱氧胸腺嘧啶核苷介导)。

(7)在正义链和反义链序列上不能有连续3个或更多的T。这可能导致shRNA的转录提前终止










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1. 影响因子为15.992

Li W, Ali T, Zheng C, et al. Anti-depressive-like behaviors of APN KO mice involve Trkb/BDNF signaling related neuroinflammatory changes[J]. Molecular Psychiatry, 2022, 27(2): 1047-1058

2. 影响因子为8.32

Li W, Ali T, Zheng C, et al. Fluoxetine regulates eEF2 activity (phosphorylation) via HDAC1 inhibitory mechanism in an LPS-induced mouse model of depression[J]. Journal of neuroinflammation, 2021, 18(1): 1-19.

3. 影响因子为5.59

Xiao P, Chen J, Zeng Q, et al. UNC5B Overexpression Alleviates Peripheral Neuropathic Pain by Stimulating Netrin-1-Dependent Autophagic Flux in Schwann Cells[J]. Molecular Neurobiology, 2022: 1-15.

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