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标准化流程，确保文库多样性>95%和均匀覆盖。步骤如下： 1. 文库设计：根据您的靶基因列表（单基因或全基因组），使用算法优化sgRNA序列（每基因4-10个sgRNA）。 2. 寡核苷酸合成：合成高纯度寡核苷酸池，包含U6启动子驱动的sgRNA。 3. 载体克隆：将寡核苷酸池克隆入慢病毒载体（如lentiCRISPR v2），转化E. coli产生质粒库。 4. 细胞转导：使用慢病毒转导目标细胞系（如HEK293或原代细胞），MOI=0.3控制覆盖率。 5. 验证与扩增：NGS测序验证文库完整性，扩增至10^8-10^9细胞规模。 输出：冻存细胞文库 + 验证报告。 基于您的需要的小鼠模型，构建可靠的体内筛选平台，确保移植成功率>90%。步骤如下： 1. 动物准备：选择对应小鼠（如B6、NSG）不同的处理以适应移植。 2. 细胞移植：静脉或皮下注射文库细胞（1-5×10^6细胞/侧），分组设置对照（非靶向sgRNA）。 3. 模型监测：跟踪肿瘤生长曲线或疾病进展，持续2-6周。 4. 组织收获：解剖收集目标组织（如肿瘤），分离富集细胞或者直接裂解。 5. 下游分析：NGS定量sgRNA丰度，鉴定富集/耗竭基因。 输出：筛选数据 + 打分基因列表 + 动物模型报告。
针对体内直接递送研究，海星提供AAV病毒文库定制，支持肝脏、脑或肌肉靶向。步骤如下： 1. 载体设计：整合sgRNA文库至AAV骨架（如AAV2/8血清型），优化ITR和启动子。 2. 病毒包装：瞬时转染HEK293细胞，HEK293T辅助包装产生高滴度病毒（>10^12 vg/mL）。 3. 纯化与滴度：密度梯度超速离心纯化，qPCR测定病毒滴度。 4. 质量控制：空壳率<10%、NGS验证文库完整性，无内毒素污染，符合注射标准。 输出：AAV病毒文库 + 滴度证书 + 序列验证报告。 |
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【2025-2026】文库体内筛选应用指南
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